Polimeraz zincir reaksiyonu (pcr) nedir? Test hakkındaki gerçekler, adımlar ve kullanılmış

PCR nedir (polimeraz zincir reaksiyonu)?

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), DNA ipliklerinin birikebileceği hemen hemen herhangi bir sıvı veya yüzeyde bulunan DNA (ve bazı durumlarda, RNA) miktarlarını izlemek için kullanılan bir tekniktir. PCR'yi anlamanın anahtarı, her insan, hayvan, bitki, parazit, bakteri veya virüsün, türlerine özgü olan DNA (veya RNA) dizileri (nükleotit dizileri veya DNA veya RNA parçaları) gibi genetik materyal içerdiğini bilmektir, ve bu türün bireysel üyesine. Sonuç olarak, eğer bir örnek DNA veya RNA segmentleri içeriyorsa, PCR bu benzersiz dizilerin çoğaltılması (daha fazla aynı kopya) yapmak için kullanılan bir yöntemdir, böylece kaynağın kimliğini çok yüksek bir olasılıkla belirlemek için kullanılabilirler. Neredeyse herhangi bir malzeme numunesinde veya üzerinde bulunan eser DNA veya RNA'nın spesifik kişisi, hayvanı veya patojenik organizması).

Bununla birlikte, PCR büyütmesi, tanımlayıcı testin sadece bir kısmıdır. Amplifikasyon yapıldıktan sonra (aşağıya bakınız), amplifiye segmentlerin bilinen bir kaynaktan (örneğin, belirli bir kişi, hayvan veya patojenik organizma) diğer nükleotid segmentleriyle karşılaştırılması gerekir. Benzersiz segmentlerin bu karşılaştırması sıklıkla, insanlar, patojenler veya diğer kaynaklardan gelen bilinen nükleotid dizilerinin yanına, ayırıcı bir jel içindeki PCR kaynaklı nükleotid dizilerinin yerleştirilmesiyle yapılır. Elektrik akımı jel içinden geçirilir ve çeşitli nükleotit sekansları, elektrik yüklerine ve moleküler boyutlarına göre bir "merdiven" e benzeyen bantlar oluşturur. Buna jel elektroforezi denir. Jellerdeki aynı seviyelere göç eden bantlar veya "merdiven" benzeri basamaklar nükleotit sekanslarının kimliğini gösterir. Bu yöntem, PCR testlerinin tamamlanmasının en popüler yollarından biridir (Bkz. Şekil 1).

Şekil 1, Mycobacterium DNA'sının (CDC izniyle) üretilen PCR basamakları gibi bantlar veya "merdiven"

Şekil. Tekrarlayan element (Rep) -PCR (A) ve darbeli alan jel elektroforezi (PFGE) (B) Mycobacterium cosmeticum kalıpları Ohio'daki 2 hastadan ve Venezuela'daki 1 hastadan izole edilir. Rep-PCR, BOXA1R primer (3) kullanılarak yapıldı ve PFGE, AseI sınırlama enzimi ile yapıldı. Şerit 1, 2, Ohio OH1 ve OH2'yi izole eder; şerit 3, 4, kontrol suşları ATCC BAA-878T ve ATCC BAA-879; şerit 5, Venezüella VZ1'i izole eder. DNA boyutu standartları 100-bp (S1) ve 48.5-kb marker (S2) 'dir.

PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) nasıl yapılır?

1983 yılında Kary Mullis, DNA dizilerini büyütmek için temel adımları buldu. O ve Michael Smith'e 1993'te bu prosedürü geliştirdikleri için Nobel Ödülü verildi. Sırayla takip edilen birkaç temel adım var; PCR, uygun kimyasallar ve özel olarak tasarlanmış bir ısıtıcı ile tek bir tüpte yapılabilir. Gereken reaktifler veya kimyasallar aşağıdaki gibidir:

• Bir nükleotit sekansı içeren bir numune (kan, saç, irin, deri kazıma, vb.)
• DNA primerleri: tamamlayıcı bir nükleotid dizisinin sentezini destekleyen nükleotit sekanslarına bağlanan kısa tek zincirli DNA
• DNA polimeraz: DNA bir primer bağlı olduğunda, tamamlayıcı baz çiftleri oluşturmak için DNA yapı bloklarını birleştiren DNA segmentinden aşağı inen ve böylece DNA'nın tamamlayıcı bir nükleotit zincirini sentezleyen bir enzim (ısıya dayanıklı bir DNA polimerazı, Taq ısıya dirençli bakterilerden türetilen polimeraz, PCR yapma kabiliyetini belirgin şekilde artırdı)
• Çözeltide, nükleotitler (Aden, Thymidin, Sitosin ve Guanine olarak adlandırılan sırasıyla sırasıyla A, T, C ve G) olarak adlandırılan çok sayıda DNA yapı bloğu vardır. Bu bloklar birbirine bağlandığında, bir nükleotit sekansı veya tek bir DNA zinciri oluştururlar. Bu yapı taşları tamamlayıcı yapı taşlarını zayıf hidrojen bağlarıyla bağladığında (örneğin, A sadece sadece T ve G ile C'ye bağlanır) tamamlayıcı bir DNA nükleotit dizisi oluşturulur ve orijinal tek sarmallı DNA'ya bağlanır. Bağlanma tamamlandığında, tamamlayıcı bir çift sarmallı DNA belirli bir dizilimde oluşturulur.

PCR, daha sonra yukarıda listelenen reaktiflerin bulunduğu bir tüpe yerleştirilen bir numuneden bir DNA segmentiyle başlar. Çözelti en az 94 ° C'ye (201, 2 F) ısıtılır; bu ısı, tamamlayıcı DNA iplikçiklerinin oluşmasına izin veren hidrojen bağlarını kırar, bu nedenle karışımda sadece tek iplikçikler bulunur (buna çift iplikli DNA'nın denatürasyonu denir).

Karışım yaklaşık 54 ° C'ye (129.2 F) soğumaya bırakıldı. Bu sıcaklıkta, DNA primerleri ve DNA polimerazı tek iplikçikli DNA'ya bağlanır (buna DNA'nın tavlanması denir). Yapı blokları karışımda fazla (yüksek konsantrasyon) olduğundan, polimeraz bunları yeni tamamlayıcı DNA iplikçikleri (DNA'nın uzatılması olarak adlandırılır) yapmak için kullanır ve bu işlem 72 ° C (161.6 F) 'de daha hızlıdır. Bu işlem, orijinal molekülün her bir telinden her birinden çift sarmallı yeni bir DNA molekülü yaratır.

Bu döngü, ısıtma-soğutma çevrimlerini her seferinde iki katına çıkaran, her bir DNA dizisinin miktarı iki katına çıkarak, ısıtma-soğutma çevrimlerini otomatik olarak tekrarlayan bir termal döngüleyici olarak adlandırılan bir makinede yaklaşık 40 kez tekrarlanır. Başlangıçta, DNA'nın kısa bir bölümü, iki katına çıktıktan sonra iki katına çıkınca 100 milyar kopyaya yükseltilebilir.

Bir doktor neden PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) testi yaptırsın?

PCR testi, hekimlerin hastaları teşhis etmesine ve tedavi etmesine yardımcı olan birçok tıbbi soruya cevap verebilecek bir dizi testin temelini oluşturur. Örneğin, PCR testleri hastalardaki patojenik organizmaları, özellikle de yetiştirilmesi zor olanları (örneğin, HIV ve diğer virüsler ve bazı mantarlar) algılayabilir ve tanımlayabilir.

Diğer doktorlar genetik hastalıkların teşhisine yardımcı olmak için PCR testleri verirken, diğer doktorlar çocukların ebeveynlerini tanımlamak gibi biyolojik ilişkileri tespit etmek için PCR kullanır. PCR testleri ayrıca belirli kanserlerde bulunan genetik mutasyonları ve yeniden düzenlemeleri tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılır.

Bununla birlikte, PCR testleri, evrimsel biyoloji, genetik parmak izi, adli incelemeler ve diğerleri gibi bilimsel araştırmaların birçok yönüne değiştirilmiş ve genişletilmiştir.

RT-PCR nedir?

RT-PCR, RNA'yı tespit etmek ve ölçmek için tasarlanmış bir PCR testidir. Her ne kadar ilk PCR testleri DNA'yı büyütse de, birçok virüs ve diğer biyolojik bileşenler (örneğin mitokondri), genetik materyalleri olarak RNA'yı kullanır. RT-PCR, ilk önce RNA alarak ve RNA zincirini bir DNA zincirine dönüştürerek geleneksel PCR'den farklıdır. Bu, esasen DNA polimeraz yerine ters transkriptaz olarak adlandırılan bir enzim kullanılması dışında yukarıda açıklanan PCR için aynı yöntemle yapılır. Ters transkriptaz, tek bir RNA zincirinin bir tamamlayıcı DNA zincirine çevrilmesine izin verir. Bu reaksiyon gerçekleştikten sonra, rutin PCR yöntemi DNA'yı yükseltmek için kullanılabilir. RT-PCR birçok RNA virüsünü tespit etmek ve incelemek için kullanılmıştır.

RT-PCR, Real-Time PCR olarak adlandırılan başka bir PCR varyasyonu ile karıştırılmamalıdır. Gerçek Zamanlı PCR, işlemin normal 40 çevrimi sırasında yükseltilmiş DNA'nın analizine izin veren bir PCR varyasyonudur. Her ne kadar prosedür bisiklete binme ile geleneksel PCR'ye benzer olsa da, Real-Time PCR bazı yapı bloklarına veya küçük nükleotit şeritlerine bağlı flüoresan boyalar kullanır. Kullanılan yönteme bağlı olarak, çoğaltılmış DNA şeritleri oluşturulduğunda floresans meydana gelir. Floresan miktarı 40 döngü boyunca ölçülebilir ve araştırmacıların amplifikasyon döngüleri sırasında belirli ürünleri ve miktarlarını ölçmelerini sağlar. Bu genellikle araştırmacıların veya laboratuvar teknisyenlerinin jel elektroforezini veya PCR ürünlerinin analizi için gerekli diğer ikincil prosedürleri atlamasına, böylece daha hızlı sonuçlar üretmesine izin verir.

Gerçek Zamanlı PCR ve RT-PCR, orijinal PCR testinin varyasyonları veya modifikasyonlarıdır. Ancak, var olan ve belirli sorunları çözmek için kullanılan birçok değişiklik var (en az 25). Hepsinin Assembly PCR, Hot-start PCR, Multiplex PCR, Solid-phase PCR ve diğerleri gibi farklı isimleri vardır.

PCR, tıp, biyoloji ile ilgili diğer soruların cevaplanmasına yardımcı olmak için değiştirilmeye devam etmesi muhtemeldir. ve diğer çalışma alanları.